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摘要：为研究海南木兰科植物香子含笑的成分及抗菌性，进而为开发植物源防腐剂提供理论依据，以生长于海南霸王领区域的香子含笑新鲜叶片为原料，经水蒸气蒸馏法提取其挥发性物质。分离纯化后，采用GC-MS技术进行化学成分分析，共鉴定出34种化合物，占总含量的88.01%。其中大多为倍半萜类，此外还包括部分单萜类及酸酯类萜的含氧衍生物。鉴定出含量最多的成分为石竹烯（11.442%）、去氢白菖烯（11.319%）、3-蒈烯（9.412%）、香木兰烯（8.981%）、氧化石竹烯（7.721%）。通过滤纸片扩散法验证香子含笑叶提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌生长有不同程度的抑制效果，其MIC分别为0.313、0.625、0.625g/mL。该研究结果是对国家林木种质资源平台中关于香子含笑成分、功能的补充，也为以该植物叶为原料开发医药、化工、食品等领域新产品提供了理论依据。
关键词：香子含笑;抗菌性;GC-MS
中图分类号：R9 文献标志码：A 论文编号：cjas18030024
GC-MS Analysis and Antimicrobial Study of Volatile Oil from Michelia hedyosperma Leaves
Yan Hao， Xu Xuefeng， Du Jinfeng
（Hainan Institute of Science and Technology， Haikou 571126， Hainan， China）
Abstract： To study the composition and antibacterial activity of Magnoliaceae plants， volatile oil was extracted by the steam distillation method from fresh leaves of Michelia hedyosperma grown in the Bawangling area of Hainan. After separation and purification， the chemical composition was analyzed by GC-MS and a total of 34 compounds were identified， accounting for 88.01% of the total composition. In addition to oxygen derivatives of monoterpenes and terpenes， most compounds belonged to sesquiterpenes. The components with higher abundance were Caryophyllene （11.442%）， Spathulenol （11.319%）， Carene （9.412%）， Aromadendrene （8.981%）， Caryophyllene oxide （7.721%）. In this study， the inhibitory effect of extracts from the leaves of M. hedyosperma on the growth of Escherichia coli， Staphylococcus aureus and Salmonella was studied using a filter paper diffusion method. The MIC for the above bacteria was 0.313， 0.625， and 0.625 g/mL， respectively. M. hedyosperma is a unique and endangered plant resource in Hainan. Under the background of building Hainan into an ecologically livable international tourism island， this study provides a valuable basis for conservation breeding and proliferation of M. hedyosperma. In addition， this study adds important information in the National Forest Germplasm Resource Platform regarding the composition and functions of the plant， and provides references for the development of new products in the fields of medicines， chemicals and foods by using the leaves of M. hedyosperma.
Keywords： Michelia hedyosperma; Antibacterial Activity; GC-MS
0 引言
香子含笑，溯危種[1]，又名黑枝苦梓，国家二级保护植物，在中国海南[2]、广西和云南等地均有分布。该植物树干通体挺拔，材质坚硬，耐腐蚀，过去常用于建筑、家具及工艺品制作等。据《本草纲目》记载，该植物种子可入药，具有清热、解毒、利尿之功效。此外该植物种子还可用于制作调味料、香薰料、保健品等，因其经济价值极高，曾被破坏性采伐，导致植株数量急剧减少，该植物自然更新能力十分有限，已成为濒危物种。近年来随着国内环保政策的实施和居民意识的提高，香子含笑的保护性利用再一次成为人们关注的焦点[1-8]。香子含笑中含有的多酚及黄酮具有抗氧化能力，有一定延缓衰老的作用，己被开发成多种保健品。笔者前期在该植物叶片中检测到经济价值极高的小白菊内酯成分[9]，该成分最早发现于菊科植物，后在木兰科植物中也发现了该成分，具有良好的抗肿瘤、抗病毒、抗炎及抑制白细胞增长等功能[10]，国内外研究十分活跃。文献表明，小白菊内酯对人体肺癌、肠腺癌及神经管细胞癌等3种肿瘤细胞离体情况下的半数致死浓度（LG50）分别为413、615、710μmol/L[11]。Parada等[12]的研究表明，小白菊内酯具有抑制关节滑膜纤维母细胞增长的功能。Feltenstein等[13]研究发现小白菊内酯可以抑制炎性大鼠关节水肿。但目前关于香子含笑叶挥发油的提取、分离及成分分析尚未见报道，本研究旨在为海南木兰科植物的开发与保护性利用提供一定参考。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
笔者以自然生长于海南霸王领区域的香子含笑为
研究对象，原料经保护区陈庆老师及海南科技职业学院张绪源博士鉴定为香子含笑，现由中国林业科学研究院热带林业研究所选育保存。研究田间试验于2017年在海南霸王领自然保护区内进行，试验区域内近年自然气候稳定，室内试验于海南南科技职业学院海南省药食同源重点实验室内进行，实验室内平均温度26℃，气压101kPa，相对湿度稳定在55%～60%，检测于海南师范大学热带药用植物化学教育部重点实验室进行。
1.2 主要仪器、材料和试剂
Agilent 7890A/5975C-GC/MSD气质联用仪，IKA10000512控制型立式旋转蒸发仪，昆山舒美KQ-300DE台式数控超声波清洗器，上海跃进LRHS-300III恒温恒湿培养箱。大肠杆菌菌种（ATCC25922），金黄色葡萄球菌（ATCC6538），沙门氏菌（ATCC14028），其他试剂均为分析纯（AR级）试剂。
1.3 试验方法
1.3.1 样品挥发性物质及抑菌成分提取 采适量新鲜叶，粉碎后，用水蒸气蒸馏法提取样品中的挥发性非水溶物，回流液再以乙酸乙酯萃取，萃取液经无水硫酸钠干燥除去水分，减压蒸馏回收乙酸乙酯，最后得到淡黄色油状物[14]。另将叶片通风干燥粉碎至80目制成粗粉，称取该粗粉10.0g，按照1：3的料液比，以质量浓度为80%的乙醇45℃下超声波提取3次，每次30min，合并滤液，减压蒸馏除去乙醇，以蒸馏水将提取液定容至20mL，配制成含量为0.5g/mL（每毫升供试样含0.5g原料的提取物）的供试样备用[15]。
1.3.2 GC-MS联用分析挥发油中主要成分 对提取的挥发性成分进行分析，顶空进样温度为100℃，定量环（1.0mL）温度110℃，传输线温度120℃，气相平衡时间5.5min，样品平衡时间7.0min，样品瓶加压时间0.1min，定量环增量时间0.5min，样品环平衡时间0.05min，进样时间1.0min[16]。
GC条件：石英毛细管柱程序升温，初温40℃，保持1min后以5℃/min升温速率，升温到200℃保持5min，再以8℃/min升温速率，升温到280℃，然后保持至完成分析，载气为高纯度氦气，柱流量1.0mL/min，压力28.8kPa，进样口温度250℃，分流比50：1[17]。
MS条件：EI电子源，能量70eV，接口温度及离子源温度分别为280、230℃，四级杆温度180℃，溶剂延迟2.5min，全扫描采集模式，荷质比范围（m/z）为50～550，扫描间隔0.50s，倍增器电压1200V。
1.3.3 抑菌效果研究 以滤纸扩散法测定香子含笑叶片提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及沙门氏菌的抑菌效果，并配制含有不同浓度提取物的系列培养基确定最小抑菌浓度MIC。
按照牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、琼脂20.0g、水1000mL的比例制作供大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及沙门氏菌培养用牛肉膏蛋白胨固体培养基。无菌条件下，取适量以上培养基装入试管摆成斜面划线法接入供试菌种后37℃下培养24h活化，以比浊法用灭菌生理盐水配制成106～107cfu/mL的菌悬液[18]。
将直径约5mm的滤纸片浸于供试液中10min，取灭菌培养基3支微热溶化，分别吸入0.1mL菌悬液，涂布均匀后37℃恒温箱中使其固化，以浸有无菌水的滤纸片对焦设置对照，37℃培养24h后，分析供试样的抑菌效果。
吸取不同体积的供试液配制成浓度为2.500、1.250、0.625、0.313、0.156g/mL的系列培养基，以不加供试液的培养基为对照，固化后每皿吸入0.1mL菌悬液涂布均匀，37℃下培养24h。分析培养结果，统计最低抑菌浓度。
2 结果与分析
2.1 GC-MS谱图
香子含笑叶挥发油经检测后得到GC-MS总离子流（TIC）如图1。
2.2 化学组成及分析结果
用面积归一化法对样品中挥发成分的相对含量进行分析，分析结果按各峰的质谱图经计算机质谱数据库检索，并将各峰的质谱裂片图与文献资料比对，检测出该挥发油中共有94种化合物，进一步与质谱数据库比对相似度90%以上的化合物有34种，结果见表1。
2.3 抑菌性或抗菌性分析及MIC测定
香子含笑提取物的抑菌作用见表2。从结果分析，提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌的生长均有不同程度的抑制作用，其中对大肠杆菌的抑制效果最好，最大抑菌圈直径9.5mm，平均抑菌圈直径为9.2mm;其次是对沙门氏菌的抑制效果，最大抑菌圈直径为9.0mm，平均抑菌圈直径为8.5mm;对金黄色葡萄球菌的最大抑菌圈直径为7.8mm，平均抑菌圈直径为7.5mm。
香子含笑提取物对3种供试菌的最低抑菌浓结果见表3。为清晰地表示香子含笑抑菌效果，本研究濃度为质量浓度（每毫升供试液中含有原料的质量）。结果表明，当供试样浓度为0.313g/mL时对大肠杆菌的生长产生良好的抑制作用，对金黄色葡萄球菌及沙门氏菌产生抑制效浓度则需达到0.625g/mL左右。
3 结论
经检测生长于海南霸王领地区的香子含笑挥发油中共有94种化合物，其中已鉴定出31种，占总成分的88.01%，主要成分为石竹烯（11.442%）[20]、去氢白菖烯（11.319%）、3-蒈烯（9.412%）、香木兰烯（8.981%）、氧化石竹烯（7.721%）。文献表明石竹烯及其氧化物可用于调配食用香精（如丁香、胡椒、柑橘等），建议用量在加香食品中浓度约为2～200mg/kg，也可用于合成乙酰基石竹烯等经济价值更高香料[21]。蒎烯常用做抗氧化剂，是一个重要工业原料。蒎烯可用于矫正一些工业产品的香味，并可做涂料溶剂、杀虫剂和增塑剂等[22-24]。
自然界中许多植物具有抗菌、抑菌作用，近年来国内外对植物源及药食同源防腐剂的研究十分活跃。文献统计表明国内已有150余种植物天然成分应用于食品防腐领域，除按照文中所述方法进行抗菌性测试外，作者还以大孔吸附树脂粗分了该植物叶片中的多酚、黄酮，并以煮熟后的猪肉、西兰花、豆腐等食物测试了其实际抗菌能力，结果表明于自然条件下该植物提取物具有明显的抑菌抗菌效果。
4 讨论
挥发油GC-MS分析难点在于分析条件的选择，也就是GC-MS离子流图中各挥发油成分的分离效果，本方法以乙酸乙酯为溶剂，在测试时间内无基线漂移现象，香子含笑叶挥发油成分离效果好，样品中化合物于4～45min内基本分离，分布时间范围宽，准确度高。香子含笑叶片的挥发油中分离出的大部分成分均可用于制作生产香料。此外在该植物中还首次发现了β-榄香烯（含量为4.181%）这一活性成分，该成分是最早从姜科植物温郁金中提取的抗癌活性成分，以该成分为主要活性物质生产的榄香烯乳注射液（Elemene Injection）可用于治疗肺癌、肝癌、鼻咽癌、骨转移癌、脑瘤等恶等多种恶性肿瘤[27]，本研究首次证实了在木兰科含笑属植物中也存在这一重要的医学原料，是作者于本科植物中发现的继小白菊内酯后又一己被应用的天然抗癌成分，是对该植物药理工功能的重要弥补。
本研究选用香子含笑叶提取物验证其对食品中常见菌的抑制作用，阐述其抑菌活性[25]，加之前期针对该植物含笑总酚、总黄酮及总酯的研究，为海南植物资源的重要价值又增加了有力依据。因本研究针仅针对叶片，属于可再生资源，故为海南省植物资源的保护性开发与利用同样提供了一定的理论支撑。
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